簡介

本文通過介紹藥物超高通量篩選（uHTS）和藥物組織分布MALDI成像兩項檢測方案，探討了近年來MALDI（基質(zhì)輔助激光解吸電離）質(zhì)譜技術(shù)在加速臨床前新藥研發(fā)方面的創(chuàng)新性應(yīng)用。

越早失敗，代價越低——這是醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域流傳的一句老生常談，多年來科學(xué)家們一直將其奉為信條。各行各業(yè)的實(shí)踐證實(shí)這一原則可以推動創(chuàng)新。制藥行業(yè)通常采用的做法，是利用技術(shù)和自動化來快速篩查化合物數(shù)據(jù)庫以尋找“目標(biāo)”，并在研發(fā)過程盡早融合吸收、分配、代謝、排泄以及毒性（ADME/TOX）等方面的研究，從而了解藥物分布和代謝的重要細(xì)節(jié)。這種做法無疑為近年來生產(chǎn)率的提升做出了貢獻(xiàn)。2015年至2016年間新藥研究同比增長估計為11.5%，其中增長幅度最高的是臨床前階段。據(jù)報道，處于這一階段的化合物從2015年的6061種增長到2016年的6861種。（1）

基本情況

關(guān)于小分子藥物研發(fā)理想的分析工具所具備的特點(diǎn)，業(yè)界已有頗多論述，比如非標(biāo)記定量技術(shù)，無需探針并能夠?qū)δ繕?biāo)分析物進(jìn)行直接檢測與定量分析。另外，快速、穩(wěn)健、易用、成本效益高并可實(shí)現(xiàn)自動化等特性也備受關(guān)注。

質(zhì)譜（MS）技術(shù)在本質(zhì)上滿足了上述諸多標(biāo)準(zhǔn)，并在過去幾年為MALDI MS開啟了新的舞臺。MALDI可與各種不同的質(zhì)量分析器聯(lián)用，最常見的是軸向TOF（飛行時間）質(zhì)量檢測器。根據(jù)分析需要也會使用MALDI與正交TOF或FT ICR（傅里葉變換離子回旋共振）等其它質(zhì)量分析器組成的質(zhì)譜儀。

目前，MALDI MS技術(shù)已在一系列新藥發(fā)現(xiàn)與開發(fā)中得到應(yīng)用，幫助研究人員識別出最具前景的小分子藥物，并向“大”制藥公司所依賴的超高通量化合物篩選項目擴(kuò)展。同樣，MALDI質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)能夠幫助開發(fā)人員在進(jìn)行定量全身放射自顯影法（QWBA）實(shí)驗(yàn)前，了解候選化合物及其相關(guān)代謝物在組織中的空間分布和組織生理情況。從而，在決定是否對候選化合物進(jìn)行下一階段研發(fā)時，幫助新藥研發(fā)人員做出明智的決定。

同樣值得注意的是，許多候選化合物會產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物。這些活性代謝物可能具有與其原型藥物不同的藥理作用和藥物動力學(xué)特性。全面了解活性代謝物的特性是毒性評估的核心，也是否決某種候選化合物的頭號原因。掌握藥物代謝酶的早期信息，對設(shè)計藥物間相互作用的研究非常有價值。

MALDI質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)流程

做MALDI成像實(shí)驗(yàn)時，首先要將組織切片固定在MALDI靶板上，并在整個組織表面添加覆蓋基質(zhì)，然后進(jìn)行激光掃描。激光在虛擬網(wǎng)格的每個離散位置上轟擊掃描組織切片，獲得質(zhì)譜圖。通過繪制組織上離子強(qiáng)度的X 和Y 坐標(biāo)函數(shù)圖像，實(shí)現(xiàn)分析物離子成像。

彈出提示：MALDI 質(zhì)譜成像（MALDI MSI）基本原理

此外，MALDI也應(yīng)用于生物制藥的質(zhì)量控制，以及基礎(chǔ)研究和臨床診斷，例如自動化的微生物鑒定。這些應(yīng)用不在本文涉及的范圍之內(nèi)。

先進(jìn)的新技術(shù)、新工具

隨著MALDI成為新藥研發(fā)領(lǐng)域功能強(qiáng)大的技術(shù)，儀器制造商們將注意力轉(zhuǎn)向了MALDI質(zhì)譜儀關(guān)鍵組件的改進(jìn)。由于企業(yè)用戶尋求改善績效、降低成本和簡化研究人員工作流程，因此系統(tǒng)組件的改進(jìn)已經(jīng)成為儀器制造商們深度開發(fā)的項目。針對不同的應(yīng)用項目，企業(yè)用戶的具體要求可能會不同，比如高通量篩選檢測方案關(guān)注的是速度、通量和每個樣本的測定成本等因素，而MALDI組織成像檢測方案注重的是成像的分辨率和檢測靈敏度。然而，為了滿足專項應(yīng)用方案的需求，而對關(guān)鍵組件進(jìn)行的改進(jìn)和優(yōu)化，都會全面提升MALDI質(zhì)譜儀的性能和檢測方案的效率。

MALDI質(zhì)譜系統(tǒng)的核心是以頻率10kHz運(yùn)行的一種高速激光器。穩(wěn)定性對于空間和質(zhì)量分辨率而言都至關(guān)重要，因此，改善透鏡、反射器和檢測器等光學(xué)系統(tǒng)的精密度，能夠大幅度提高儀器的性能。圖1 為典型的TOF / TOF離子光學(xué)路徑。

重要的是，擴(kuò)展MALDI質(zhì)譜系統(tǒng)的性能范圍需要高速激光器。當(dāng)今的尖端系統(tǒng)意味著需要用10 kHz的激光器，但采用10 kHz 激光器需要先解決許多技術(shù)和機(jī)械問題。例如，傳統(tǒng)的MALDI-TOF質(zhì)譜儀的設(shè)計是激光點(diǎn)固定不動，樣品靶板根據(jù)激光點(diǎn)的位置進(jìn)行移動并定位。要讓機(jī)械裝置足夠快速、準(zhǔn)確地移動樣本以跟上高速激光器的頻率并非易事。布魯克通過擺脫傳統(tǒng)思維的束縛，采用固定樣品靶板的位置，而移動激光器的方法，充分實(shí)現(xiàn)了10 kHz激光器的潛力。

此外，在檢測器設(shè)計方面的一項成果值得注意，即在學(xué)術(shù)上廣受好評的動態(tài)和諧ParaCell ?被整合到了solariXTMXR 系統(tǒng)。由莫斯科俄羅斯科學(xué)院Eugene Nikolaev 教授和他的同事們共同開發(fā)的ParaCell ?創(chuàng)新設(shè)計技術(shù)，可以在寬質(zhì)譜范圍內(nèi)穩(wěn)定離子回旋共振信號。在不要求高通量時，solariXTM XR 是可以獲得千萬級分辨率的質(zhì)譜儀器。此外，該儀器還能在更高采集速率下提供分辨率大于250000（m/z 400 / 1s / 7T）的基準(zhǔn)測試性能。 承載多項創(chuàng)新技術(shù)的solariXTM XR近乎完美的滿足復(fù)雜混合物MALDI成像的要求，是一臺迄今無可比擬的質(zhì)譜儀。

當(dāng)要求質(zhì)譜儀以超出常規(guī)的速度進(jìn)行常規(guī)分析時，快速分析面臨的挑戰(zhàn)包括儀器的控制、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)處理程序等都是需要重點(diǎn)考慮的因素。與傳統(tǒng)MALDI儀器不同的是，如今新一代質(zhì)譜系統(tǒng)為了滿足超快的分析速度，會采用諸如并行計算線程等策略。

實(shí)踐中的創(chuàng)新：

為了滿足藥物超高通量篩選（uHTS）檢測方案的需求，布魯克研發(fā)人員采用上述新技術(shù)， 成功的將rapifleX MALDI PharmaPulseTM儀器打造成測樣速度比傳統(tǒng)儀器快20倍，性能更穩(wěn)健、檢測更靈敏，質(zhì)量范圍更寬的高端MALDI-TOF 質(zhì)譜系統(tǒng)。

2016年美國質(zhì)譜年會（ASMS）期間，來自英國葛蘭素史克制藥公司的Peter Marshall博士等研發(fā)人員以墻報的形式，展示了他們?nèi)绾瓮ㄟ^將MALDI-TOF質(zhì)譜儀與納升液相色譜儀相結(jié)合，每周完成100萬以上樣本篩選。這項工作在配備了10 kHz激光器的布魯克MALDITOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)條件：m/z 80 -400 或700 – 3500質(zhì)量范圍，每個樣本的激光轟擊數(shù)為200次。該系統(tǒng)可在7.36分鐘內(nèi)完成1536孔靶板的測定（也就是1536個樣品!）。如果要處理更龐大數(shù)量的內(nèi)部候選化合物，通過簡單計算可知，分析200 萬種化合物僅需要7.85天。整個方案的穩(wěn)定性評估表明，108次測定前后的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

圖1 - TOF / TOF 質(zhì)譜（2）的離子光路

他們的結(jié)論是，uHTS（超高通量篩選）技術(shù)和方法不僅穩(wěn)定，而且分析速度非?？臁Ｔ撔〗M每周測定超過100萬個樣本，并且發(fā)現(xiàn)即使測定超過200萬樣本也無需清洗離子源。最后，為實(shí)現(xiàn)更高的通量，該小組還使用6144孔板取得了類似的檢測結(jié)果。如果納入常規(guī)應(yīng)用，這將使篩選200萬種化合物所需時間縮短至2.39天。

相比之下，如果需要利用MALDI質(zhì)譜成像（MALDI MSI）技術(shù)探明模型組織內(nèi)的藥物及其代謝產(chǎn)物分布，那么布魯克 solariX 質(zhì)譜系統(tǒng)是最佳選擇。傳統(tǒng)的方法是通過采用定量全身放射自顯影法（QWBA）或液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）分析法來獲取藥物分布和代謝。但兩者都存在不足。QWBA是一種功能強(qiáng)大的技術(shù)，所生成的數(shù)據(jù)為世界各地的監(jiān)管機(jī)構(gòu)所接受。但是QWBA 得到的是總放射性，其中可能包括原型藥物、代謝物、雜質(zhì)和降解產(chǎn)物等放射計數(shù)的總和。因此，QWBA對于研究人員希望探尋藥物在體內(nèi)的生化途徑和代謝機(jī)理的需求，QWBA存在嚴(yán)重的局限性。

LC/MS分析的對象是組織勻漿提取物。這項技術(shù)無法顯示任何空間信息，更為嚴(yán)重的是，可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)。例如，如果組織中的某個分析物在局部高度集中，提取與均漿過程將會產(chǎn)生稀釋作用，從而掩蓋了該分析物局部高濃度的真相，而得出相對較低濃度值，有時甚至?xí)陀跈z測限。如果藥物或代謝物出現(xiàn)局部蓄積，通常表明該藥物可能存在毒性，測定組織勻漿提取物往往無法準(zhǔn)確定位藥物在組織中的分布。另外，如果來自組織勻漿的某項分析物被確定具有較高濃度，研究員則可能得出錯誤的毒性結(jié)論，因?yàn)檠芯咳藛T可能會認(rèn)為該藥物應(yīng)該是均勻分布于整個組織。

與LC/MS方法截然不同，MSI方法采用常規(guī)組織切片作為待測樣品。首先用基質(zhì)覆蓋組織切片，這樣不僅可以將組織中的化合物分子提取到組織表面，而且仍然保留了這些化合物在組織中的空間關(guān)系。組織切片樣品制備就緒后， 用MALDI-TOF質(zhì)譜測定。檢測結(jié)果為具有空間分辨特性的質(zhì)譜圖。因?yàn)榧す鈨H轟擊到組織切片表層的基質(zhì)結(jié)晶，底層細(xì)胞特性未受影響，所以該組織切片可以通過常規(guī)的組織染色標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行染色，從而得到高質(zhì)量的組織影像。將組織影像結(jié)果與MALDI 質(zhì)譜分子成像信息相結(jié)合，有可能實(shí)現(xiàn)直接測定組織獲得組織學(xué)檢測結(jié)果。

最近M. Reid Groseclose等評估了用大鼠進(jìn)行的抗癌藥物達(dá)拉菲尼（DAB）腎毒性研究，認(rèn)為MALDI MSI提供的信息達(dá)到甚至超過LC/MS。這項研究旨在支持推動DAB用于兒科患者。先前的研究發(fā)現(xiàn)在幼鼠身上出現(xiàn)了一些意想不到的不良腎影響。這些不良影響在成年鼠的研究中并未出現(xiàn)。（3）

圖 2 - 來自 PND 7-13 幼鼠腎組織切片的質(zhì)譜成像圖（4）

MALDI MSI的初步試驗(yàn)結(jié)果就可以確定DAB 及其代謝物在腎臟中的分布（圖2）。隨后對腎小管沉積物進(jìn)行分析，提供了沉積物的化學(xué)成分，完成了達(dá)拉菲尼用于兒科治療的風(fēng)險評估。這一評估較單獨(dú)采用LC/MS 分析法的結(jié)果更為完整。

結(jié)論

制藥公司正在尋求創(chuàng)新型方法與技術(shù)，以推動安全、有效的新藥快速投放市場。正如我們所見，MALDI技術(shù)已經(jīng)對小分子藥物的研發(fā)產(chǎn)生了影響，不少行業(yè)分析人士相信，未來幾年這種影響還將顯著增強(qiáng)。MALDI技術(shù)首先應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，隨即在常規(guī)uHTS 和MSI 應(yīng)用中證明其價值。所以頗具前瞻性的研究人員們正在對這種最新儀器設(shè)備進(jìn)行投資并且拓展應(yīng)用范圍，以待在藥物早期開發(fā)過程中對候選化合物獲得更多的認(rèn)識和更深入的了解。

參考資料

1.Pharmaprojects 2016. Pharma R&D Annual Review of 2016

2.Castellino S, Groseclose MR, Wagner D. 2011. MALDI imaging mass spectrometry: bridgingbiology and chemistry in drug development (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22074284/[Accessed 15/12/2016]

3.M. Reid Grosclose et al, 2015. Imaging MS in Toxicology: An Investigation of Juvenile Rat Nephrotoxicity Associated with Dabrafenib Administration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:887:898. DOI: 10.1007/s13361-015-1103-4 (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25804893 [Accessed 15/12/2016]

4.Groseclose, M.R., Laffan, S.B., Frazier, K.S. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26: 887. doi:10.1007/s13361-015-1103-4