細胞培養(yǎng)作為生命科學研究中的核心技術(shù)，其應用已從最初的試管中培養(yǎng)蛙神經(jīng)纖維，發(fā)展到如今涵蓋基因工程、藥物開發(fā)和疫苗生產(chǎn)等多個領域。然而，即使技術(shù)不斷進步，細胞培養(yǎng)面臨的主要障礙仍然是污染問題。培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)豐富環(huán)境同樣也是各種污染物繁殖的理想場所。與體內(nèi)有免疫系統(tǒng)保護的細胞不同，培養(yǎng)瓶中的細胞缺乏免疫反應，更容易受到機會性病原體的侵襲。

 

污染會顯著影響細胞生長，改變細胞形態(tài)，增加死亡率，進而影響實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)可靠性。本文將深入探討細胞培養(yǎng)中常見的污染類型，如何盡早識別和處理污染，以及如何徹底預防污染，確保細胞健康生長。

 

 

 

Part 1

細胞培養(yǎng)污染的主要類型

 

支原體污染

 

支原體是細胞培養(yǎng)實驗室中最常見且最難發(fā)現(xiàn)的污染源之一，因為它們在標準光學顯微鏡下不可見。支原體是微小的原核生物，缺乏細胞壁，僅表達約 800 kbp 的微小基因組，相比之下，細菌的平均基因組大小為 5 mbp。盡管有這些差異，支原體被認為是從革蘭氏陽性菌退化演變而來，并保留了獨立于其他細胞復制的能力。

 

細胞培養(yǎng)中最常見的支原體種類包括發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans）、口腔支原體（Mycoplasma orale）和精氨酸支原體（Mycoplasma arginine）。污染源通常來自動物源性試劑和操作人員交叉污染，甚至是實驗室人員自身。大規(guī)模篩查表明，15-35% 的連續(xù)細胞系都受到支原體感染，而細胞系在實驗室之間的頻繁傳遞為其傳播提供了充分機會。

 

雖然支原體污染在受感染的培養(yǎng)物中不會產(chǎn)生任何可見或形態(tài)學癥狀，但它可以對細胞功能產(chǎn)生深遠影響，包括基因表達、蛋白質(zhì)合成與分泌以及代謝的改變。這反過來會顯著影響使用受污染細胞進行實驗所產(chǎn)生數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性，甚至改變癌細胞系對化療的反應。

 

即使識別出支原體污染，也極難根除：由于缺乏細胞壁，支原體對許多標準組織培養(yǎng)抗生素不敏感；而其微小尺寸又使其能通過大多數(shù)過濾器。因此，最好定期進行污染篩查，特別是當新細胞系引入實驗室時。

 

 

細菌污染

 

細菌污染是另一種常見的細胞培養(yǎng)污染類型。由于細菌在大多數(shù)環(huán)境中普遍存在，它們很容易通過不良的無菌技術(shù)或用于加熱培養(yǎng)基的被污染水浴引入培養(yǎng)物中。常見的細菌污染物包括大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、腸球菌（Enterococcus malodoratus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis），它們都是環(huán)境中常見或正常人類微生物群的組成部分。

 

細菌污染物能在有利的組織培養(yǎng)基環(huán)境中迅速繁殖，通?？赏ㄟ^培養(yǎng)基的視覺變化輕易識別。大量細菌會導致培養(yǎng)基pH值下降，含酚紅指示劑的粉紅色培養(yǎng)基會變成黃色。如果污染細菌是需氧的，還會使培養(yǎng)基變渾濁，這與正常的非貼壁細胞的外觀不同。

 

 

真菌污染

 

由于真菌在環(huán)境中的普遍存在和以孢子形式長期存活的能力，使用不良無菌技術(shù)處理的細胞培養(yǎng)物容易被真菌污染。#真菌污染 通常由霉菌或酵母引起。

 

#酵母污染：酵母是通過出芽繁殖的單細胞真核生物。大多數(shù)酵母的復制速度快于微生物細胞，因此它們能迅速與細胞培養(yǎng)物競爭營養(yǎng)豐富的環(huán)境。初始污染通常不會引起顏色變化，但重度污染會使培養(yǎng)基變渾濁。它們在培養(yǎng)中表現(xiàn)為橢圓形生物，通常比培養(yǎng)細胞小，可通過其「出芽」繁殖方式識別，這種方式形成細胞鏈。最常見的酵母污染來自念珠菌屬（Candida）。

 

#霉菌污染：與單細胞生物污染不同，霉菌污染在后期階段非常明顯。霉菌如常見污染物曲霉菌（Aspergillus）和青霉菌（Penicillium），是產(chǎn)生長絲狀菌絲和大型菌落的多細胞生物。在污染早期，它們可能表現(xiàn)為白色、黃色或黑色的模糊點，隨后發(fā)展成漂浮在培養(yǎng)基中或附著在培養(yǎng)瓶側(cè)面的毛茸茸的大片。真菌孢子能長期存活，幾乎無處不在。它們通常通過空氣傳播感染培養(yǎng)物，污染幾率會隨季節(jié)變化，因為空調(diào)或暖氣的增加使用或空氣中花粉含量高會增加霉菌污染的可能性。

 

 

病毒污染

 

#病毒污染 是最難檢測的污染類型之一，因為病毒是必需的細胞內(nèi)生物，在光學顯微鏡下不可見。雖然一些病毒污染物如皰疹病毒和腺病毒會導致可見的細胞死亡，但其他（如逆轉(zhuǎn)錄病毒）則是無聲的污染物，它們建立慢性感染而不影響細胞生長，如果沒有針對已知物種的特定基因分析或電子顯微鏡，極難識別。

 

與其他類型的污染（通常來自環(huán)境或操作人員）不同，病毒污染往往源于細胞系本身。例如，20 世紀 50 年代和 60 年代，從恒河猴分離用于脊髓灰質(zhì)炎疫苗的腎細胞后來被發(fā)現(xiàn)受到猿猴病毒 40（SV40）的污染。在某些情況下，被人類或人畜共患病毒如人類免疫缺陷病毒（HIV-1）和淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）污染的細胞可能使科學家面臨感染風險，需要比未受污染細胞更高的生物安全級別。

 

 

其他類型的污染

 

除了細菌、真菌、支原體和病毒外，還存在其他類型的細胞培養(yǎng)污染，包括寄生蟲、朊病毒、化學污染和來自其他細胞系的交叉污染。

 

#寄生蟲污染

 

來源：原代培養(yǎng)物中可能發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)寄生原蟲，包括弓形蟲（Toxoplasma gondii）、隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）和瘧原蟲（Plasmodium）。

檢測：細胞內(nèi)寄生蟲的視覺檢測因寄生蟲而異，但可通過 PCR 等測試確認疑似污染。

預防：高風險原代細胞培養(yǎng)物在使用前應進行寄生蟲污染測試，并使用適當?shù)姆雷o方法處理此類細胞系，避免實驗室獲得性感染。

 

#朊病毒污染

 

來源：某些細胞系可能易感朊病毒感染，這可能源于胎牛血清（FBS）補充劑。

檢測：朊病毒無法通過視覺檢查培養(yǎng)物檢測，但應測試有風險的試劑。

預防：使用低朊病毒風險的高質(zhì)量培養(yǎng)基補充劑，并定期測試試劑批次。

 

#化學污染

 

來源：包括來自塑料器皿或試劑的洗滌劑、激素、重金屬和增塑劑。內(nèi)毒素可從細胞培養(yǎng)基和補充劑引入。某些培養(yǎng)條件如強熒光照射可誘導自由基。

檢測：難以觀察，但會抑制生長和復制。

預防：確保水和試劑經(jīng)過重金屬污染測試；只使用可靠來源的、經(jīng)認證低內(nèi)毒素水平的培養(yǎng)基和補充劑；可向培養(yǎng)基添加維生素 A 或 E 等自由基清除劑。

 

#種內(nèi)和種間交叉污染

 

來源：來自同一物種或另一物種的不相關細胞系。

檢測：具有不熟悉或不同形態(tài)或意外特征的細胞過度生長。常規(guī)測試也可檢測污染。

預防：任何新細胞系進入實驗室時都必須進行表征，現(xiàn)有細胞系應定期測試，因為交叉污染可能導致不可靠和不可重復的發(fā)現(xiàn)。測試可通過基因測序或同工酶分析進行。

 

 

 

Part 3

如何識別細胞培養(yǎng)中的污染

 

在了解污染外觀之前，需要知道健康培養(yǎng)中細胞應有的樣子。形態(tài)、貼壁性、培養(yǎng)基渾濁度和顏色的變化可能是污染的警示信號，有助于決定測試、處理和監(jiān)測的最佳方案。此外，了解污染源可能的來源有助于在問題發(fā)生前預防。尋找污染模式可以幫助識別微生物的潛在來源，如臟水浴、新試劑或無菌技術(shù)失誤。

 

常見污染物的來源與檢測

 

支原體

 

來源：動物源性試劑和操作人員交叉污染。

檢測：結(jié)合常規(guī)細胞系測試，觀察細胞生長率或形態(tài)變化。

處理/預防：受感染的細胞系應丟棄，實驗室消毒。對不可替代的細胞可使用特異性抗支原體抗生素。所有進入實驗室的新細胞系應隔離并使用市售測試試劑盒進行測試。

 

細菌

 

來源：不良無菌技術(shù)、在受污染水浴中加熱的試劑和操作人員交叉污染。

檢測：培養(yǎng)基視覺變化（如顏色變化或渾濁）或細胞生長變化。在顯微鏡下可能看到運動的細菌細胞?？墒褂梦⑸锱囵B(yǎng)技術(shù)或 PCR 確認污染。

處理/預防：受感染的細胞系應丟棄，實驗室消毒。對不可替代的細胞可使用抗生素。無菌技術(shù)是最佳預防方法。

 

真菌

 

來源：不良無菌技術(shù)、在受污染水浴中加熱的試劑和操作人員交叉污染。

檢測：霉菌易于視覺識別，表現(xiàn)為培養(yǎng)基中的毛茸茸斑塊。酵母污染可能導致培養(yǎng)基渾濁，在顯微鏡下可見出芽鏈。

處理/預防：受感染的細胞系應丟棄，實驗室消毒。對不可替代的細胞可使用抗真菌藥物。無菌技術(shù)是最佳預防方法。

 

病毒

 

來源：原代細胞培養(yǎng)物，從其他細胞系水平傳播。

檢測：某些細胞病變病毒可能導致細胞死亡，而其他物種只能通過電子顯微鏡識別?？赏ㄟ^基于細胞或PCR的測定確認污染。

處理/預防：受感染的細胞系應丟棄，實驗室消毒。應評估安全協(xié)議以防止實驗室獲得性感染。新的高風險細胞系應隔離并測試。

 

 

Part 3

如何去除細胞培養(yǎng)污染

 

最佳措施是立即處理任何受污染的培養(yǎng)物，并消毒可能與受污染培養(yǎng)物接觸的所有物品，包括水浴、培養(yǎng)箱、層流罩或II級生物安全柜。根據(jù)污染源，可能還需要測試或處理試劑，或重新培訓工作人員。

 

然而，在某些情況下，處理細胞系可能不可行。如果不可替代的細胞系受到污染，可以嘗試消除或控制污染物，前提是它是細菌、真菌或支原體。

 

首先要確定污染物類型：是細菌、支原體、真菌還是病毒？支原體、細菌和真菌的金標準是培養(yǎng)，但這可能需要幾天時間，而控制污染需要更快的方法。因此，可以使用 PCR、DNA 染色或測序等更快的方法。市售支原體測試試劑盒也隨時可用。

 

以下是處理受污染細胞培養(yǎng)的步驟——

 

1. 隔離受污染的培養(yǎng)物并徹底清潔實驗室，使用適當?shù)南緞?/p>

2. 某些處理可能對細胞有毒，可能需要進行劑量反應測試?？梢允占芪廴镜募毎麘乙?，以標準稀釋度接種到新鮮的平板或瓶中，然后添加不同濃度的適當抗生素或抗真菌藥物。應觀察細胞幾天，尋找毒性跡象（如生長不良、脫落和變圓）。

3. 確定潛在毒性后，可將細胞系在含適當濃度抗菌劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2-3 代。

4. 在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代，然后再在處理過的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2-3 代。

5. 在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞幾代，確定污染是否已清除。如果仍顯示污染跡象，重復步驟 4-5。

 

 

Part 4

何時及如何使用細胞培養(yǎng)抗生素

 

抗生素可用作治療以清除細菌或支原體污染，但許多實驗室也將其作為標準培養(yǎng)基中的預防措施。青霉素和鏈霉素等抗生素混合物在使用前添加到培養(yǎng)基中，以防止細菌污染。預防性抗生素在某些情況下可能有用（如原代細胞培養(yǎng)、關鍵實驗或選擇基因修飾細胞）。然而，過度使用或誤用抗生素可能產(chǎn)生不良影響。

 

抗生素的持續(xù)存在可能創(chuàng)造一種虛假的安全感，導致忽視良好無菌技術(shù)的實施。一項主要研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)使用抗生素培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物比不使用抗生素培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物有十倍多的支原體污染。此外，持續(xù)使用抗生素可能導致緩慢生長的抗生素耐藥生物污染，這些生物對細胞行為造成微妙變化，但難以識別或消除。

 

長期在細胞培養(yǎng)中使用抗生素也會影響細胞本身。研究表明，青霉素和鏈霉素的抗生素處理可影響基因表達，潛在改變細胞分化和蛋白質(zhì)去磷酸化等細胞行為，而利福平可誘導全基因組變化。因此，應仔細考慮細胞培養(yǎng)中長期使用抗生素的副作用，特別是在敏感研究中，良好的無菌技術(shù)可取得相同結(jié)果。

 

 

Part 5

如何避免細胞培養(yǎng)污染

 

雖然某些形式的污染有可用的處理方法，但這可能很耗時，并對之前使用同一細胞系進行的實驗所收集的數(shù)據(jù)提出質(zhì)疑。高度污染的細胞系可能必須處理掉，以防止傳播到實驗室中的其他細胞系。如果庫存細胞系被污染，所有受感染的庫存可能需要銷毀。因此，在幾乎所有情況下，預防確實比治療更好。

 

預防污染有幾種途徑，這些應在新細胞系一到達實驗室就啟動。新細胞系是最常見的污染源之一，所有新細胞系都應在單獨的實驗室或II級生物安全柜中隔離，并在引入一般實驗室前測試常見污染物如細菌和支原體。如有可能，細胞系也應進行測試以確認其身份。一旦細胞系在實驗室建立，應定期進行質(zhì)量控制，包括常規(guī)污染測試。任何動物源性試劑如FBS在使用前應進行處理，例如紫外線照射。

 

許多實驗室在標準細胞培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素等抗生素混合物，盡管這些可能產(chǎn)生負面影響?？偟膩碚f，預防細胞培養(yǎng)污染的最佳方法是擁有訓練有素的工作人員，遵循良好的無菌技術(shù)，在干凈、維護良好的實驗室中工作。

 

自方法早期以來，細胞培養(yǎng)中對無菌技術(shù)的需求就已經(jīng)很明顯。哈里森的研究曾因反復的細菌污染而受到挑戰(zhàn)，直到他采用了無菌技術(shù)。

 

良好的無菌技術(shù)和正確使用認證的生物安全柜對高效、無污染的細胞培養(yǎng)實驗室至關重要。此外，經(jīng)過培訓能在最早階段發(fā)現(xiàn)污染的操作人員可以通過盡早處理污染來幫助控制微生物的傳播。全面的清潔計劃也是預防污染的重要因素，通過減少實驗室中環(huán)境微生物的數(shù)量。

 

層流罩和生物安全柜在每次使用后都應消毒，例如使用乙醇和紫外線。用于加熱培養(yǎng)基或解凍試劑的水浴應定期清潔和消毒，任何溢出物或廢物都應消毒并適當處理。進入生物安全柜的任何設備都應用乙醇或其他適當消毒劑擦拭，細胞培養(yǎng)直接接觸的所有物品都應是一次性和無菌的。

 

通過訓練有素的工作人員、干凈的實驗室和常規(guī)污染監(jiān)測，可以最小化污染風險，維持充滿健康、無污染細胞培養(yǎng)的實驗室。

 

 

參考資料：

Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber. Exp Biol Med. 1906;4(1):140-143.

Roth JS, Lee TD, Cheff DM, et al. Keeping it clean: the cell culture quality control experience at the national center for advancing translational sciences. SLAS Discov. 2020;25(5):491-497.

Barile MF, Hopps HE, Grabowski MW, et al. The identification and sources of mycoplasmas isolated from contaminated cell cultures. Ann New York Acad Sci. 1973;225(1):251-264.

Ryu AH, Eckalbar WL, Kreimer A, et al. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 2017;7(1).

 

來源：榮格醫(yī)藥商情

作者：John Xie